Terminátorský CRISPR nájde rakovinové bunky a rozseká ich DNA. Zdravé v testoch obišiel
Vedci otestovali nový CRISPR proteín Cas12a2, ktorý po rozpoznaní chorej bunky rozdrví jej DNA. Zasiahol rakovinové aj HPV bunky, zdravé obišiel.
Klasický CRISPR funguje ako presné molekulárne nožnice. Proteín Cas9 nájde vybrané miesto v DNA a prestrihne ho, aby bunka poškodený úsek opravila alebo aby vedci mohli gén vyradiť či zmeniť. Cas12a2 ide opačným smerom. Nič neopravuje. Po aktivácii začne ničiť DNA celej bunky.
Práve táto vlastnosť zaujala tím z University of Utah Health. Vedci chcú Cas12a2 využiť proti bunkám, ktoré nesú vírusovú RNA alebo nádorovú mutáciu. Namiesto opravy chorého génu by systém odstránil celú bunku, pričom zdravých buniek bez hľadaného znaku by sa nemal dotknúť.
Cas12a2 čaká na konkrétnu molekulu RNA. Tá vzniká, keď bunka podľa génu vyrába proteín, a funguje ako dočasná pracovná kópia genetickej informácie. Keď proteín rozpozná cieľovú RNA, prepne sa do ničivého režimu a začne vytvárať rozsiahle dvojvláknové zlomy v chromozomálnej DNA. Bunka také poškodenie nezvládne, zastaví delenie a väčšinou spustí apoptózu, teda riadenú bunkovú smrť.
Bez správnej RNA zostal skartovač DNA vypnutý
Najväčším problémom každej liečby, ktorá zabíja bunky, je selektivita. Chemoterapia poškodzuje najmä rýchlo sa deliace bunky, preto zasahuje aj zdravé tkanivá. Cas12a2 sa má rozhodovať podľa presne vybranej RNA sekvencie. Ak ju bunka nemá, ničivá aktivita sa nespustí.
V štúdii publikovanej v časopise Nature bunky bez cieľovej RNA nevykazovali merateľný nárast poškodenia DNA a ďalej sa množili podobne ako neošetrené bunky. Platilo to aj v spoločnej kultúre s bunkami, v ktorých sa Cas12a2 aktivoval. V laboratórnych podmienkach teda poškodenie nepreskočilo na okolité bunky, ktoré hľadanú RNA nemali.
Neprehliadni
Výsledok však nemožno zamieňať s dôkazom, že budúca liečba bude bez vedľajších účinkov. Testy prebehli prevažne na bunkových líniách a správanie systému v ľudskom tele môže ovplyvniť množstvo ďalších faktorov.
Cas12a2 zasiahol bunky s HPV, zdravé nechal nedotknuté
Vedci nastavili Cas12a2 tak, aby rozpoznával RNA vírusových génov E6 a E7, ktoré sa nachádzajú v bunkách infikovaných vysokorizikovými variantmi HPV. Ide o vírus spájaný najmä s rakovinou krčka maternice, no môže prispievať aj k ďalším nádorom.
Po aktivácii klesol rast HPV pozitívnych buniek o viac než 90 percent, zatiaľ čo bunky bez vírusu zostali bez merateľného zásahu. Výskumníci následne vpichli HPV-zacielený systém priamo do nádorov vytvorených z infikovaných buniek u myší. Rast nádorov sa spomalil, čo ukázalo, že mechanizmus môže fungovať aj v živom organizme.
Priama injekcia do nádoru však obišla jednu z najťažších častí budúcej liečby. Vedci zatiaľ nemajú vyriešené, ako dostať Cas12a2 po podaní do tela presne do chorého tkaniva, v dostatočnom množstve a bez toho, aby ho zachytili iné orgány.
Cas12a2 rozpoznal rakovinovú bunku podľa jedinej mutácie
Ďalší pokus mieril na mutáciu KRAS G12C, ktorá podporuje rast niektorých nádorov vrátane rakoviny pľúc. Mutovaná a zdravá verzia RNA sa líšia jediným nukleotidom, teda jedným „písmenom“ genetického kódu. Cas12a2 napriek tomu dokázal rozpoznať chorú verziu.
V kultúre ľudských buniek rakoviny pľúc znížil rast buniek s mutáciou približne o 50 percent. Bunky so zdravým KRAS nevykazovali porovnateľné poškodenie. Presnosť však nebola automatická. Z troch navádzacích RNA, ktoré vedci navrhli, fungovala dostatočne selektívne iba jedna. Každý nový cieľ preto bude potrebovať vlastné testovanie.
Cas12a2 využili aj ako filter po génovej editácii. V bunkách, kde sa požadovaná zmena nepodarila, zostala pôvodná RNA sekvencia a tá aktivovala ničivý mechanizmus. Úspešne upravené bunky prežili. Takýto postup by mohol pomôcť pri laboratórnej príprave bunkových terapií, kde treba oddeliť správne upravené bunky od zvyšku.
Cas12a2 nehľadá chybu v DNA. Sleduje, čo bunka práve vyrába
Cas9 dokáže zasiahnuť aj jedinečný úsek DNA. Pri pokuse zabiť celú bunku však jeden rez často nestačí, pretože bunka ho opraví. Staršie metódy preto mierili na opakujúce sa časti genómu, kde Cas9 vytvoril veľa zlomov naraz. Takýto prístup však nevie rozlíšiť, či je konkrétny gén v bunke práve aktívny.
Cas12a2 sleduje RNA, a teda to, čo bunka v danom momente skutočne produkuje. Aktivoval sa aj pri transkriptoch, ktorých bolo v bunke málo. To je dôležité pri mutáciách alebo vírusoch, ktoré nemusia vytvárať veľké množstvo RNA.
Problém nie je v tom, kde Cas12a2 reže. Rozhoduje, čo ho spustí
Pri Cas9 vedci sledujú, či proteín nenarezal DNA aj mimo plánovaného miesta. Pri Cas12a2 má off-target účinok inú podobu. Aktivovaný proteín zámerne poškodzuje DNA naprieč celým genómom, takže mapovať jednotlivé rezy veľký zmysel nemá. Rozhodujúce je, či sa systém nespustí po kontakte s podobnou RNA v zdravej bunke.
Autori preto navrhujú kombinovať počítačové vyhľadávanie podobných transkriptov s laboratórnymi testami poškodenia DNA a bunkovej smrti. Pozornosť si vyžadujú aj bunky, ktoré útok prežijú. Oprava množstva zlomov môže zanechať nové mutácie alebo chromozomálne prestavby. Pri protirakovinovej liečbe by tak nestačilo sledovať, koľko buniek zahynulo. Dôležité bude aj to, čo sa stalo s preživšími.
Pred klinickými skúškami musia vedci vytvoriť menšie a presnejšie varianty Cas12a2, zlepšiť návrh navádzacích RNA a vyriešiť dopravu do tkanív. Doterajšie výsledky ukazujú, že programovateľné ničenie buniek podľa ich RNA podpisu je možné. Práve doprava a kontrola nesprávneho spustenia rozhodnú, či Cas12a2 zostane laboratórnym nástrojom, alebo sa raz dostane aj k pacientom.
